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Piuma生物纳米压痕仪在软骨去细胞化基质支架用于修复骨软骨缺损

 发布时间:2022/8/17 点击量:97

一、介绍

   为了寻求产生终身保持功能的软骨修复组织的技术,已经探索了广泛的方法。1.虽然有些技术,如自体软骨细胞植入(ACI)的各种变体2和关节分散注意力3,产生有希望的临床结果,这些方法都没有被证明可以完全恢复适当的透明软骨。另一种在再生医学的其他领域(如膀胱,气管和肠道的恢复)中产生了非常有希望的结果的替代技术是使用基于去细胞化细胞外基质(ECM)的支架。4.该技术的优点是创建了一个天然ECM元素的环境,该环境可能仍然包含各种适当的生物活性线索,而没有细胞成分的存在,从而避免了免疫学问题5,6。此外,它确实允许异种方法,因为ECM蛋白在物种之间高度保守。研究已经证明了软骨衍生基质(CDM)支架的潜力,因为培养的间充质基质细胞形成了丰富的新的含糖胺聚糖(GAG)和含II型胶原的软骨基质 7.在异位6,8和原位位置的小动物模型中的体内研究进一步强调了效力9,10。

   CDM支架对于修复骨软骨缺损可能很有趣,因为它们可以定制成骨软骨塞,可以以压接方式插入,避免不安全或复杂的固定技术,这些技术可能会对周围和相对组织造成损伤11.它们也有可能成为现成的产品,因为不需要植入前培养。然而,这种方法需要同时再生骨和软骨组织。从理论上讲,这可以通过使用复合支架或单个支架来实现,该支架将允许根据周围的原始组织形成两个组织。

   在这项研究中,开发和使用了一种基于CDM的支架。CDM主要由II型胶原蛋白组成,在没有GAG和细胞的情况下12 并且单独使用,或与三维(3D)打印磷酸钙(CaP)水泥基经过验证的成骨支架1314结合使用以填充马的股骨颅关节中的骨软骨缺损。马模型被视为骨科疾病的*佳和挑战性的模型之一1516。据推测,骨软骨缺损的软骨部分会随着新组织接近透明软骨而愈合,并且复合支架将显示更好的骨形成并导致更好的整体解剖重建。

二、方法

   (1)实验设计

   支架植入直径为11 mm,深10 mm的圆柱形缺陷,这些缺陷是通过手术在内侧股骨车嵴的轴侧形成的。进行了为期8周的试点研究,以评估对CDM支架的短期反应。为了减少实验动物的使用,使用了一匹注定要被牺牲用于教育目的的马。在这种情况下,没有使用CaP脚手架。在为期6个月的主要研究中,每匹马都接受了单独使用CDM支架(−P)和由CDM和3D打印CaP支架(+P)组成的复合支架的治疗。马1-4分别接受了左股骨和右股骨叶关节的治疗-P和+P。对于马5-8来说,这是颠倒的。

      (2)手术

   在用甲苯噻嗪(1.1mg / kg,比萨)静脉注射(IV)术前后,静脉注射(2.2mg / kg,霍利迪)和(0.05mg / kg,霍利迪)诱导马匹,并将其置于背卧位。 氧气中使用异氟醚维持全身麻醉。

   通过中髌韧带和内侧髌韧带之间5 cm的切口进行颅股骺小型关节切开术17。每个内侧股骨滑车嵴中侧的骨软骨缺损是使用动力驱动的钻头形成的。在植入前用盐水溶液(Careflex)冲洗缺陷部位和关节。将支架压接植入每个缺陷中。将伤口缝合成四层(关节囊,深筋膜浅筋膜和皮肤),并在切口上施加支架绷带。

    (3)生物力学测试

   对来自同一动物的健康软骨和缺陷组织进行了微压痕实验。使用带有球形压头(半径:73μm,悬臂刚度:15.6 N/m)的位移控制纳米压头机(荷兰Piuma)获得基于压痕的载荷-位移曲线18.3 × 3 压痕矩阵 (n = 9),覆盖 600 × 600 μm2执行区域,对应于每个点之间的300μm距离。实际压痕深度在8微米范围内。杨氏模量是根据奥利弗-法尔理论计算的,使用卸载曲线的初始斜率和估计泊松比0.519.

   经过生物力学测试,将一半样品固定在福尔马林中,并进一步加工用于石蜡包埋。从剩余的组织样品中,切除缺陷的软组织并进行处理以进行生化分析

三、结果

   (1)尸检时的宏观外观

   时,手术部位很容易通过软骨上的压痕识别(图3);而在植入时点,植入物已小心地与周围的软骨齐平。所有部位的外观相似,治疗之间没有宏观上可见的差异。

图 3

图 3.尸检时手术部位的宏观视图(植入后6个月)。

    (2)生物力学分析

   生物力学测试表明,−P和+P处理的缺陷的修复组织都非常柔软(平均杨氏模量302 KPa(CI 177-427)分别为−P和261 KPa(CI 148-374),刚度明显小于正常相邻软骨(平均杨氏模量为−P 2385 KPa(CI 2009-2761), 对于 +P 2372 KPa (CI 2036–2708) (P < 0.0001))。−P组和+P组的修复组织之间没有差异(P>0.05)(图5)。

图 5

图 5.Young修复组织模量与仅用CDM(−P)或CDM加CaP支架(+P)治疗的病变的正常软骨的模量。*P < 0.0001,n = 8 表示所有组。

  (3)生物化学

       根据组织学观察,缺陷中的GAG产生有限。−P条件下的GAG,DNA和GAG / DNA值分别为25.67(CI 17.27–34.07)μg/mg组织,1.57(CI 1.35–1.79)μg/mg组织和16.54(CI 12.09–20.99)。对于−P,这些值为12.32(CI 9.88-14.82);分别为1.74 (CI 1.63–1.85) 和 7.13 (CI 6.63–8.63)。对于胶原蛋白参数,HYP值为11.63(CI 10.47-12.79)和8.78(CI 7.03-10.53)Hyp / mg组织。−P组和+P组间的GAG和胶原蛋白含量无显著差异(图6)。

图 6

图 6.平均GAG(A)和羟脯氨酸(HYP,μg / mg干重;(B)作为胶原蛋白含量的量度,6个月后修复组织的含量。

四、讨论

 

        自组织工程早期以来,关节软骨一直是目标组织之一。22.然而,很快就发现,在经典的较小实验室物种中进行广泛的体外测试,虽然在初始发育阶段仍然是绝对必要的,但不足以评估临床环境中旨在修复软骨或再生的任何疗法。23.在较大的模型中,马模型被认为是模型之一,但也被认为是挑战性的模型之一。16.优点包括关节的大小和可及性,软骨的厚度和生化成分,这些都接近人类24,以及软骨下板是闭合的,这在许多较小的物种中并非如此。在模型的缺点中,也许手术后立即承重可能是最重要的25.关于马模型的一个重要的伦理考虑因素是,马是主要为了运动潜力而繁殖和饲养的动物。这使得马与任何其他物种不同,除了狗之外,成为一个实验物种,以及一个目标物种,显然临床上需要更好地治疗(骨)软骨关节疾病。26.

   在这项研究中,马模型用于评估用无细胞CDM支架填充人造骨软骨缺损的效果,使用(+P)或没有(−P)陶瓷基底在软骨下骨中压接锚定。在为期8周的试点研究中,仅植入CDM植入物的结果与先前使用这些支架68的体内异位研究以及兔子的原位植入910的有希望的结果一致。在支架的位置,可以看到骨骼和软骨阶段的再生,尽管可以注意到关节表面的明显压痕。然而,试点研究的结果被认为足够令人鼓舞,有理由进行更大规模的长期研究。

   虽然在主要研究中,临床症状(如跛行或关节积液)受到限制,并且并非在所有马匹中都可见,但在6个月时尸检时的缺陷填充令人失望,并且在所有治疗动物中明显低于试点马匹。宏观和组织学分析证实存在大压痕和下修复组织。从生物力学上讲,这种组织的硬度平均比来自同一匹马的健康软骨的样本低90%。相比之下,来自支架骨部分的3D打印CaP水泥很好地整合到周围的骨组织中,类似于以前的原位研究1327。虽然水泥的主要部分已被吸收并被新形成的骨头取代,但在植入部位内仍然可以看到剩余的碎片。X射线衍射(XRD)分析清楚地证实,作为支架主要成分的刷子和莫氏石被完全吸收,只能发现少量残留的β-TCP,这可能是由于β-TCP的溶解度(∼0.4 mg / l)低于刷石(85 mg / l)和monetite(41 mg / l)28.所有衍射图谱均显示纳米晶HA是主要成分,因为2Theta = 25.8°和31–35°左右的宽峰。这种透明质酸可能在支架植入后直接从α-TCP水解为缺钙的透明质酸后形成29,或在较长的时间后通过在Ca存在下将刷石转化为HA2+.后者通常出现在原位植入后的刷状生物水泥中30,因为该化合物在生理pH值下热力学不稳定。由于所用XRD的横向分辨率为几毫米2,HA也可能来自支架残基旁边新形成的骨矿物质。

    在长期研究中,有几个因素可能导致植入物的性能有限。在去细胞化支架中,已知去细胞化过程的功效会影响宿主反应,并且在体外更积极的去细胞化与巨噬细胞表型优势从M1到M2的转移有关。31.虽然没有得到很好的研究,但兽医的临床印象是,与其他物种相比,马对免疫原性刺激相对敏感,这可能也影响了本研究中植入支架的命运。另一个潜在的非常重要的因素是最初的生物力学负荷,包括剪切和压缩,植入的支架从马匹从麻醉中恢复的那一刻起就一直受到。这是马模型的一个的缺点。25,这是由于马匹无法长时间卸载其四肢之一而没有严重的并发症。此外,CDM支架有限的整体机械性能可能通过阻碍力传递到下层骨骼而导致失效,最终导致这些区域的骨质流失。这强调了对机械稳定性更高的需求,例如,纤维增强结构3233,用于处理这些机械上具有挑战性的位置的缺陷。

通过包含再生细胞以进一步增强组织形成,结果也可能进一步改善。然而,当设想现成的解决方案(即无细胞结构)时,这将是一个复杂的因素。

    综上所述,长期马研究的不良结果与体外,异位体内和短期体内试点研究观察到的有希望的结果不一致。在临床上表现惊人的地方,只有相对轻微的跛行,在长期研究中,与为期8周的试点研究的结果相比,观察到非常有限的缺陷填充。因此,这项研究强调了在评估治疗关节缺陷的再生方法时,在具有挑战性的模型中进行长期研究的必要性,即使体外工作甚至短期体内研究的结果可能是有希望的,因为治疗效果可能会被高估。结果还表明,在长期研究期间,例如通过成像技术或滑液组成的高级分析,进行越来越多的深入监测可能具有实质性的附加值。

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