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Optics11生物纳米压痕仪测量生物材料基底PDMS、细胞、生物组织刚度,硬度

 更新时间:2023-05-08 点击量:553

题目:

基体刚度对梗死边界机械耦合和力传播的影响

抽象

异质细胞间耦合在心脏的机械和电信号传输中起着重要作用。尽管许多研究已经研究了心肌组织内肌细胞和非肌细胞之间的电信号传导,但研究机械对应物的研究并不多。本研究旨在研究在健康和心脏病发作模拟基质僵硬条件下,底物硬度和心肌成纤维细胞(CMF)的存在对心肌细胞(CMs)和CMFs机械力传播的影响。使用与荧光显微镜集成的生物纳米压痕仪测量CM产生的收缩力及其在CMF中的传播,以实现快速钙成像。我们的结果表明,较软的基质有助于更强和更进一步的信号传输。有趣的是,CMF的存在以刚度依赖的方式衰减了信号传播。与具有CMF的软基质相比,存在CMF的较硬基质使信号衰减约24-32%,表明心肌梗死后基质刚度增加和CMF数量增加对心肌功能具有协同不利影响。此外,CMF运动在CM-CMF边界处的跳动模式也取决于基板刚度,从而影响CM产生的收缩力的传播波形。我们进行了计算机模拟,以进一步了解不同力传递模式的发生,并表明在CM-CMF界面处组装的细胞-基质粘附(根据基板刚度而不同)在决定信号传输的效率和机制方面起着重要作用。总之,除了底物刚度外,受底物刚度影响的细胞-细胞和细胞-基质相互作用的程度和类型也会影响心肌组织中肌细胞和非肌细胞之间的机械信号传导。

材料和方法

纳米压痕仪实验装置

应变率相关刚度测量

使用Piuma Chiaro纳米压痕系统(Optics11,荷兰阿姆斯特丹)(26)测试天然心脏组织块,具有不同刚度的PDMS底物以及PDMS底物上培养的CMF细胞的硬度

使用直径为90 μm的胶体探针测试具有不同刚度的PDMS基板。用于软基板的压痕探头的弹簧常数为0.43 N/m,而用于中等和刚性基板的探头的弹簧常数为4.21 N/m。针对每个PDMS底物条件测试了三个单独的样品,并从每个样品的不同位置记录了多个测量值。所有样品共记录了204-390个压痕数据点。

用于在PDMS衬底上接种的CMF的压痕探头的弹簧常数和直径分别约为0.045 N / m和41 μm。针对每种底物类型,在两个独立样品上总共测试了45种不同的CMF细胞。在测试之前,悬臂的灵敏度校准是通过压痕硬表面(即载玻片)进行的。使用的加载速度分别为 50、2 和 0.2 μm/s。开发了一个定制的MATLAB代码(The MathWorks,Natick,MA),以确定探针和样品之间的接触点,并使用赫兹接触模型(2733)识别样品的杨氏模量:(1)=1691/2δ3/2,其中F是施加的力,δ是压痕深度,R是胶体探针的半径,E是样品的杨氏模量。假设样品是不可压缩的(即泊松比为0.5),因为使用该模型的文献研究得出的结论是,当泊松比从20.0到3.0(5)变化时,测量的性质变化小于34%,因此,假设大多数生物样品的不可压缩性是合理的(3536).使用单因素方差分析进行统计,以95%置信水平报告统计学意义(p < 0.05)。

收缩力测量

通过驻留实验(23)用纳米压痕仪测量细胞片内单个CM和CMF的收缩力。简而言之,将纳米压痕探针与样品接触,并且探针的位移保持恒定(换句话说,探针驻留在样品上)30秒以动态测量其偏转,这与电池沿横向相对于基板的收缩力成正比。

首先,我们测量了共培养样品上与CM-CMF边界相邻的单个CM的收缩力,以及没有任何CMF的对照样品上CM-PDMS边界处的CM。然后,依次测量单个CMF的收缩力,每次在距边界更远的距离处测量,如图1 A所示,直到没有可检测到的信号。所有跳动力测量均在细胞核上进行,以确保一致性,并尽量减少细胞刚度异质性的影响。每次测量后,悬臂沿X轴移动,并在最近的CMF上进行测量。因此,所有测量都是在距边界相似的距离处进行的,根据最近CMF的确切位置,差异仅为~5-10%。所用探头的弹簧常数和直径分别为0.067 N/m和5.4 μm。开发了定制的 MATLAB 代码来分离每个单拍并计算平均收缩力。

CMF 尺寸测量

为了开发本研究中的FEA模型,通过图像分析和纳米压痕测量测量了CMF的尺寸(即细胞直径和高度)。首先,我们通过测量新附着的球形CMF的直径和高度来计算单个CMF的体积,该CMF在细胞接种后不超过15分钟接种在培养皿上,以确保细胞仍呈球形。简而言之,捕获了这些球形细胞的明场图像,并通过使用ImageJ绘制两条从细胞中心穿过的对角线来测量直径,以获得D0.然后,这些球形细胞的高度,H0,通过使用纳米压痕仪压进细胞及其旁边的基板并记录细胞-基底接触点(33)来测量。这些尺寸用于计算细胞的体积V0如下:


最后,我们测量了在不同刚度基材上播种并铺展的CMF的高度。由于扩散的CMF的不规则形状,我们假设细胞体积被保留,而不管细胞的形状调制,同时扩散(3738)。基于这一假设并使用第 V 卷0并测量了不同刚度基板上展开的CMF的CMF高度H,我们使用以下公式计算了不同PDMS基板上CMF的直径D

结果

加载速度相关的机械性能

首先,我们通过纳米压痕实验研究了天然组织基质、具有不同刚度的制备PDMS底物以及在这些基质上接种的CMFs的粘弹性。我们观察到不同PDMS基板的测量刚度的变化取决于压痕的加载速度。PDMS基板刚度是在三种不同的加载速度(即50、2和0.2 μm/s)下测量的,如图1 B所示。当加载速度从50 m/s降低到2 μ m/s和从2 μm/s(p < 0.2)降低时,基体的刚度显著降低,但软基体的刚度从0 m/s降低到0001 μm/s(p = 50.2)时除外。同样,在不同PDMS衬底上晶种的CMF表现出加载速度依赖性刚度(p <0.1484),当加载速度从0 m/s降低到005.2 μm/s(p = 0.2)时,在中等衬底上接种的CMF除外(图0 C)。为了进行比较,测量了天然大鼠心脏组织的硬度,该硬度也随着加载速度从1924降低到1.50 μm / s(p < 0.2)而降低。

PDMS衬底和在PDMS衬底上晶种的CMF均表现出应变速率依赖性刚度。软底物刚度约为13.9-17.66 kPa,与天然健康心脏组织的硬度相似(即11.33-18.46 kPa (6)),因为我们测量的健康成年大鼠心脏为13.32±8.60 kPa,而中度和僵硬底物的硬度分别为83.29-105.71和483.92-529.63 kPa,与早期研究中测量的梗死心脏组织的硬度相当(4, 5). 同样,在软、中和硬基底上接种的 CMF 的刚度分别为 0.95–3.02、2.06–4.96 和 1.61–5.47 kPa。可以看出,正如预期的那样,电池刚度随着基板刚度的增加而增加(44)。这种加载速度依赖性刚度与先前在组织和细胞(上的发现一致3345)。


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Optics11成立于2011年,是阿姆斯特丹自由大学(VU)的衍生组织。从那时起,这家初创公司的收入和员工持续增长,成为荷兰发展最快的公司之一,并具有国际影响力。Optics11 Life提供功能强大的新型纳米压痕仪,与传统的同类产品相比,使用方便、功能多样、坚固耐用。主要用于测量复杂、不规则的生物材料,如单细胞、组织、水凝胶和涂层的机械性能。

Piuma Nanoindenter

生物组织、软物质材料力学性能测试的新方法

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Piuma是功能强大的台式仪器,可探索水凝胶、生理组织和生物工程材料的微观机械特性。表征尺度从宏观直至细胞。专为分析测试软材料而设计,测量复杂和不规则材料在生理条件下的力学性能。杭州轩辕科技有限公司

主要优势

● 内置摄像镜头,方便实时观察样品台

● 实时分析计算测量结果,原始数据并将以文本文件存储,方便任何时候导入Dataviewer软件进行复杂处理

● 探针经过预先校准,即插即用。对于时间敏感的样品确保了快速测量

● 光纤干涉MEMS技术能够以无损的方式测量即使是最软的材料,并保证分辨率。同时探针可以重复使用Piuma轩辕纳米压痕仪Piuma轩辕纳米压痕仪

                                           

技术参数

+
模量测试范围

5 Pa - 1 GPa

探头悬臂刚度0.025 - 200 N/m
探头尺寸(半径)

3 - 250 μm

最大压痕深度100 μm
传感器最大容量200
测试环境air, liquid (buffer/medium)
粗调行程

X*Y:12×12 mm          Z:12 mm

加载模式

Displacement / Load* / Indentation*
测试类型

准静态(单点,矩阵)

蠕变,应力松弛

DMA动态扫描 (E', E'', tanδ)

动态扫描频率*
0.1 - 10 Hz
内置拟合模型Young's Modulus (Hertz / Oliver-Pharr / JKR)
*为可选升级配置


Fiber-On-Top 探头

新型光纤干涉式悬臂梁探头,利用干涉仪来监测悬臂梁形变。638115393727713280157.jpg


相较于原子力显微镜或传统纳米压痕仪

创新型光纤探头,弥补了传统纳米压痕仪无法测试软物质的问题,也解决了AFM在力学测试中的波动大,操作困难、制样严苛等常见缺陷。


● 背景噪音低:激光干涉仪抗干扰强于AFM反射光路

● 制样更简单:对样品的粗糙度宽容度高于AFM

● 刚度选择更准确:平行悬臂梁结构有利于准确判别压痕深度与压电陶瓷位移比例关系,便于选择合适刚度探头来保证弹性形变关系的稳定性,进而获得重复率更高、准确性更好的数据



内置分析软件

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● 借助功能强大而易于操作的软件,用户可以自由控制压痕程序(载荷、位移等)。自动处理曲线的流程,可以获得数据和结果的快速分析


● 原始参数完整txt导出,便于后续复杂处理的需要


● 利用Hertz接触模型从加载部分计算弹性模量,与常用的Oliver&Pharr方法相比,更为适合生物组织和软物质材料特性



视频介绍


近期文献



年  份期  刊题  目
2022Advanced Functional MaterialsEngineering Vascular Self-Assembly by Controlled 3D-Printed Cell Placement
2022BiomaterialsHydrogels derived from decellularized liver tissue support the growth and differentiation of cholangiocyte organoids
2021Biofabrication3D bioprinting of tissue units with mesenchymal stem cells, retaining their proliferative and differentiating potential, in polyphosphate-containing bio-ink
2021nature communicationsJanus 3D printed dynamic scaffolds for nanovibration-driven bone regeneration
2020Environmental Science & TechnologyEffect of Nonphosphorus Corrosion Inhibitors on Biofilm Pore Structure and Mechanical Properties
2020Acta BiomaterialiaA multilayer micromechanical elastic modulus measuring method in ex vivo human aneurysmal abdominal aortas