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细胞循环机械拉伸系统在肺上皮细胞的应用

 更新时间:2023-03-27 点击量:376

一、背景

呼吸机引起的肺损伤 (VILI) 是急性肺损伤 (ALI) 或急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 患者最常见的并发症之一。虽然p120是调节细胞连接的重要蛋白质,但应探索预防和治疗VILI的进一步机制。

二、方法

用p12小干扰(si)RNA,p120 cDNA,野生型E-钙粘蛋白并列膜结构域或K120R突变并列膜结构域(K83R-JMD)转染的小鼠肺上皮细胞(MLE-83)进行20%循环拉伸2或4小时。此外,用c-Src抑制剂PP预处理的MLE-12细胞和小鼠2或RhoA抑制剂Y27632,分别经历20%的循环拉伸或机械拉伸。此外,野生型C57BL / 6小鼠在机械通气前转染p120 siRNA-脂质体复合物。然后分析细胞裂解物和肺组织以检测肺损伤。

三、结果

20%活性c-Src的循环拉伸,诱导E-钙粘蛋白,p120和封闭素的降解。然而,p120的缺失增加了E-钙粘蛋白的降解和内吞作用。免疫沉淀和免疫荧光结果显示p120和E-钙粘蛋白之间的关联降低,而p120 siRNA和K83R-JMD组在20%循环拉伸后间隙形成增加。p120的缺失还降低了闭塞素水平,并通过增强RhoA活性降低了闭塞素和ZO-1的关联。然而,封闭素和E-钙粘蛋白水平的改变被PP逆转2或Y27632处理与循环拉伸组相比。一致地,p120过表达组在20%循环拉伸后,连接蛋白的表达、再分布和解离均恢复。此外,p120在机械通气下通过增加湿/干称重比和增加p120耗尽小鼠细胞因子(肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-六)的产生来证实p<>在VILI中的作用。

细胞机械循环拉伸

图1

环状拉伸对粘附连接蛋白和紧密连接蛋白的影响。将柔性细胞板上的MLE-12细胞单层经受20%循环拉伸2或4小时。 (a)蛋白质印迹显示p120,E-钙粘蛋白和封闭素在循环拉伸后减少。(b) 提取膜和细胞质蛋白。通过蛋白质印迹测定E-钙粘蛋白在膜和细胞质中的表达。周期性拉伸可诱导E-钙粘蛋白内吞作用。(c)免疫荧光染色和定量数据显示p120和E-钙粘蛋白在循环拉伸下结合。固定MLE-12细胞并用抗p120和抗E-钙粘蛋白染色,然后用Alexa偶联的二抗染色。(d)肌动蛋白细胞骨架重塑是通过用德克萨斯红偶联鬼笔环肽(红色)进行免疫荧光染色来确定的。由循环拉伸引起的细胞间隙用箭头标记。细胞核(蓝色)用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。比例尺 = 10 μm。*p < 0.05 与对照组相比,+p < 0.05 与 CS 2 h 组相比。实验至少重复三次

四、结论

p120通过调节粘附和紧密连接来防止VILI。p120通过增加p120与E-钙粘蛋白的并列膜结构域之间的关联来抑制E-钙粘蛋白内吞作用。此外,p120通过抑制RhoA活性来减少闭塞素的降解。这些发现说明了p120预防VILI的进一步机制,特别是对于ALI或ARDS患者。

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HOW TO USE

1. 细胞外基质涂层进行预处理,将细胞接种到腔室中,细胞粘附在基底上,开始过夜培养过程。

2. 细胞增殖后,选择拉伸模式并开始循环刺激。

3.  根据实验目标收获/处理细胞,分析数据。

优势

· 均匀负载
培养腔室采用预埋横杆技术,保证每个细胞都沿着拉伸轴均匀地承受应变,非轴向方向上的次级载荷极低
· 高再现性
高精度步进电机保证在各种速度和拉伸比组合中实现一致的运动程序,机械稳定性与拉伸膜的优越弹性相结合,保证高度可重复的力学刺激
· 一体式控制
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ARM芯片,高效稳定运行的同时简单易用
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有效拉伸面积
32×32mm,PDMS材质基底适配各种实验室分析技术,包括细胞固定和荧光成像等


设备参数


外形尺寸                              350x330x110 mm
主机重量                             3 kg
拉伸腔体                              4个,32x32 mm / 8个,20x20 mm
控制模式                              三角波、正弦波、方波及其组合
最大应变率                           30%
最高拉伸速率                        30 mm/s
最高循环频率                        2 Hz
基底膜厚度                           0.2 mm
使用环境                              CO2培养箱




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