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Optics11公司PIUMA纳米压痕在水凝胶中的应用

 发布时间:2022-11-28 点击量:250

题目:人心房成纤维细胞对基质刚度异质性的适应

(如果需要完整文献请与我们工作人员联系,可试样)

摘要:纤维化与衰老和许多心脏病有关。其特征在于肌成纤维细胞分化和细胞外基质蛋白的过度积累。纤维化相关的组织重塑导致组织结构和功能的显着变化,包括被动机械性能。随着最近开发的新工具和方法,该研究领域获得了显着的发展,以更好地表征和理解细胞感知和响应其生物物理环境的能力。我们使用一种称为CyPhyGel的新型水凝胶来提供与重塑相关的组织硬度变化的先进体外模型。基于蓝藻光敏色素的光控二聚化,它能够以高空间和时间分辨率对水凝胶机械性能进行非接触式和可逆调谐。在CyPhyGels上培养人原代心房成纤维细胞。在硬质(~4.6 kPa)或软质(~2.7 kPa)CyPhyGels上培养4天后,我们分析了成纤维细胞面积和硬度。与在较硬的基质上生长的细胞相比,在较软的基质上生长的细胞更小更软。当软质和硬质生长底物组合在单个CyPhyGel中时,不存在这种差异,产生的细胞面积与均质刚性凝胶上的细胞面积相似,细胞刚度与均质软基质上的细胞刚度相似。使用CyPhyGels在体外模拟组织硬度异质性,我们的结果证实了心脏成纤维细胞适应其机械环境的能力,并表明存在一种旁分泌机制,该机制可以调整与机械诱导的表型向肌成纤维细胞转化相关的成纤维细胞结构和功能特性。在局部组织硬度增加的情况下,例如在瘢痕形成或弥漫性纤维化时,这种机制可以帮助防止正常组织和患病组织之间边界区域的细胞特性突然变化。CyPhyGeles的光可调机械性能及其对研究人类原代心脏细胞的适用性使其成为心脏力学生物学研究的有吸引力的模型系统。进一步的研究将探索生物物理和可溶性因素在心脏成纤维细胞对空间和时间异质机械线索的反应中的相互作用。

一、介绍

由于衰老、机械超负荷或损伤等原因引起的心脏组织损伤与纤维化的发展有关。纤维化的特征在于肌成纤维细胞分化和细胞外基质(ECM)蛋白的过度积累(Herum等人,2017)。这种重塑主要是由成纤维细胞驱动的(Manabe等人,2002;Travers等人,2016),组织结构和力学的变化,其后果从心输出量受损到心律失常脆弱性增加(Nguyen和Qu,2014)。最终,纤维化的存在和程度是心脏性猝死的主要危险因素(Disertori等人,2016)。到目前为止,还没有有效的治疗方法来逆转心脏纤维化,主要是由于对潜在的基本机制了解不足。

可能的治疗方法必须考虑组织力学的变化,这既是重塑的原因,也是重塑的结果。成纤维细胞对其机械环境的感知已被证明在纤维化重塑中发挥作用(Hinz,2013;范普滕等人,2016 年)。近年来,已经开发了几种体外模型来研究成纤维细胞机械传感。这些模型中的主要一类使用合成基材,包括水凝胶和有机硅。这些允许研究人员规定培养细胞的机械环境(Rosales和Kristi,2016;李等人,2018)。或者,天然存在的底物,如脱细胞组织(Ott等人,2008)或活的心脏组织切片(Perbellini等人,2018)已被用于为细胞提供近生理生长底物,但这些是更复杂且可重复性较差的模型。更接近地模拟体内条件的底物是的,因为当ECM生产克服退化时,纤维化组织的整体刚度提高(Levental等人,2010),刚度分布是高度异质的。具有或多或少ECM的区域构成了不同的机械微域。在弥漫性纤维化中,例如在心房颤动中,僵硬的ECM岛分布在较软的组织中(Tanaka等人,2007)。鉴于对单细胞的机械效应主要由其微环境主导,体外模型应复制这些刚度异质性,理想情况下以可控的方式。

允许在机械性能中引入空间梯度的模型已被用于证明成纤维细胞的刚度引导迁移,这一过程称为durotaxis,取决于基质蛋白的类型(Hartman等人,2017)。此外,具有微图案刚性和软区域的水凝胶用于显示细胞在各种刚度上的适应性(Sunyer等人,2012),并研究基质组织对间充质干细胞分化的作用(Yang等人,2016)。然而,这些模型不允许人们在时间或空间上动态和可逆地改变生长基质的被动机械性能。基于蓝藻光敏色素Cph1的新型水凝胶系统(我们在这里称为CyPhyGel)可以通过允许水凝胶硬度的光控,可逆变化来解决这一限制(Hörner等人,2019b)。为此,使用细胞兼容的红光在其单体(740nm)或二聚体(660nm)形式之间切换Cph1,从而分别以非接触方式减少或增加生长基质中的交联数量。CyPhyGels的刚度可以在1.5和5.5 kPa(有效杨氏模量)之间变化。刚度的变化发生在照明的几秒钟内,是可分级的,在没有光线的情况下是稳定的,并且是可逆的(Hörner等人,2019b)。在这项研究中,我们使用CyPhyGels来研究人类心脏成纤维细胞对杜罗抗性以外机械环境刚度异质性的适应。

二、材料和方法

CyPhyGels和成纤维细胞的纳米压痕

有效杨氏模量,E伊芙,使用Chiaro纳米压痕系统(Optics11,荷兰阿姆斯特丹)进行评估。连接到校准悬臂上的球形用于压痕样品,同时将激光束照射到反射悬臂表面上。对反射的激光进行干涉分析,以测量与悬臂弯曲相关的相移。由此计算出样品压痕所需的力。E伊芙使用接触力学的赫兹模型推导(赫兹,1881;陈,2014)假设不可压缩材料的泊松比为0.5,通常用于细胞和组织的机械测试(图1B;Guz 等人,2014 年)。在整份手稿中,E伊芙称为刚度。以5 μm/s的置换速度进行2–4 μm的样品压痕。数据分析使用 Optics11 DataViewer (V2.0.27)。

Chiaro人体组织和软材料的机械性能-杭州轩辕科技有限公司

对于CyPhyGel表征,使用了弹簧常数为0.45–0.5 N/m且半径为20–23 μm的悬臂。对于细胞评估,使用弹簧常数为0.01-0.02 N/m的悬臂和半径为3-3.5μm的。通过在两到三个与细胞核不重叠的不同位置进行表面法向压痕来确定单个细胞的刚度。对于每个压痕,使用赫兹模型来拟合从初始细胞表面接触到1μm压痕的力 - 位移曲线,以避免来自底层生长基质的机械干扰。在接种CyPhyGels后4天评估细胞硬度。

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结果

通过光调节CyPhyGels的机械性能

均匀暴露在660 nm照明下的CyPhyGels具有E伊芙4.59 ± 0.11 kPa,而用 740 nm 照明后,E伊芙分别为 2.72 ± 0.06 kPa(图 2A,)。相似的最大值和最小值 E伊芙发现了异质CyPhyGels的两个差异调谐的一半。为了对刚度梯度进行空间表征,以50μm的步长绘制了异质CyPhyGels,沿着垂直于其刚性和软性两半之间边界的线绘制。E伊芙从 4.48 ± 0.58 变为 2.12 ± 0.30 kPa(图 2C)。在边界附近使用更高分辨率的步长(5μm),我们发现刚性和软区域之间的过渡发生在100-150μm的宽带内(图2D)。边界区域的宽度至少在1毫米以上是恒定的(补充图S3)。

图2




图2.CyPhyGels的机械性能。(A)本实验中使用的CyPhyGel配置的示意图。(二)E伊芙的CyPhyGels,暴露于660或740nm(n = 24)的均匀照明或顺序照明,因此机械异质(n = 4),通过纳米压痕测定。(三) E伊芙沿着垂直于三个代表性异质CyPhyGels的刚性和软性两半之间边界的轴,说明了凝胶刚度的阶跃变化(连续测量点之间的距离为50μm,n = 3)。(D)从图C对凝胶3中的过渡区域进行更高分辨率的评估(测量点之间的距离为5μm)。(E) E伊芙在照明后(第0天)和6天后立即从图C获得凝胶3,对应于实验的持续时间。


为了评估CyPhyGel刚度的异质性是否随时间推移而持续,在顺序照明后6天测量了刚度,这对应于实验的持续时间。具有不同刚度的两个区域仍然清晰可辨(图2E)。6天内柔软区域的硬度略有增加是由于在CyPhyGel处理和细胞培养过程中暴露于外部光线(补充图S2)。

结论

我们提出了一种新的体外模型,适用于研究对基质刚度局部和时间变化的动态生物学反应。该模型将用于阐明不同机械微环境中细胞之间的通信机制,例如模拟纤维化或瘢痕性心肌。我们的结果表明,心脏成纤维细胞对生长基质机械特性的适应可以通过旁分泌因子以及直接的细胞 - 细胞接触调节。

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生物组织纳米压痕仪介绍
Piuma纳米压痕仪的核心部件是其安装在压痕移动平台上极其敏锐的压痕探头
1.压痕移动平台,具备粗进以及精进两级移动精度,使得探针可以自动寻找到表面并且提供高精度压痕。除了压痕移动平台,Piuma纳米压痕仪还有一个手动样品移动平台
2.方便样品的安放。你的样品可以放在X-Y移动台上Piuma Nanoindenter微纳压痕仪厂商

3.进行杨氏模量的测试或者进行多点阵测试。一个内置式的显微镜
4.可以直接观察实验过程!Piuma Nanoindenter微纳压痕仪厂商

 

生物组织纳米压痕仪是一个简单易用的革命性产品,为软物质以及生物材料组织的微观以及纳观研究带来希望。依靠自身*的新型光学技术以及杰出的微加工工艺,Piuma纳米压痕仪可以测量杨氏模量软的样品,范围甚至是从5Pa到5GPa!Piuma同样非常适合在液体中测试样品。其操作非常简单易学,只需将探头插入仪器中,简单定标后,即可马上开始压痕实验。

产品构件详细介绍
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纳米压痕仪核心:一个微加工工艺制作的光学压痕探头
2.SAMPLE样品
从水凝胶到骨组织等,在大气中或者浸没在液体中
3.SAMPLEXYSTAGEXY样品台
在X-Y(12x12mm)范围内测试样品
4.INDENTATIONSTAGE压痕移动台
粗进以及精进移动台实现精确压痕以及自动寻找样品表面
5.MANUALSTAGE手动平台
为任何样品以及容器创造空间

 

纳米以及微米级别的生物机械性能

Piuma是一个创新的,具有成本效益的工具,用来表征生物材料、组织、细胞器、细胞层、软骨、静电支架、力学性能,3D打印材料,水凝胶等的微纳米机械性能。

The Piuma 纳米压痕仪专为迎合生物材料以及组织研究人员和工程师的需求,提供易用性和便携性,同时提供高精度、高通量和多样化的数据。Optics11小型化的玻璃探针式压头,特别适合在液体中测量水合样品。组织工程和再生医学的研究者,Piuma纳米压痕仪是衡量他们感兴趣材料刚度的一个解决方案。 

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软物质材料表征

在生物材料、组织工程、再生医学和医学研究领域,Piuma可以在溶液里进行非破坏性测量测量某点或者某个区域的杨氏模量、蠕变和松弛实验,点阵测量粘附力,描述应变硬化行为,样品的粘度等。测试生物材料和组织样本的软硬度可以很容易地在Piuma纳米压痕仪上用其optics11 PIUMA探头和专用的Piuma软件来实现。 

Piuma Nanoindenter是荷兰Optics11公司出品的新型生物纳米压痕仪。主要应用范围为生物组织、生物支架、水凝胶、聚合物、细胞等软物质以及生物材料的机械性能研究。采用了新型探头设计,弥补了传统其他纳米压痕仪无法测试软物质的问题也解决了原子力显微镜在软物质测试中的数据波动大,操作困难、制样严苛等常见问题。更开创性的在压痕仪中加入了动态力学测试模式DMA,可以获得材料与振动频率相关的储存模量、损失模量和损失因子,用于研究材料在交变力作用下的滞后现象和力学损耗。