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Optics11公司PIUMA压痕仪在细胞研究中的应用

 发布时间:2022-11-28 点击量:331

题目:上皮和基质角膜硬度的变化随年龄和肥胖而发生

(如果需要完整文献请与我们工作人员联系,可试样)

简介:

角膜是无血管的,这使其成为研究基质蛋白表达和组织硬度的模型。角膜上皮粘附在基底区,下面的基质由角质细胞和广泛的胶原蛋白和蛋白聚糖基质组成。我们的目标是检查8周和15周小鼠的角膜变化,并将其与15周前2型糖尿病肥胖小鼠进行比较。对角膜上皮进行纳米压痕原位,然后对上皮进行磨损,并在基底膜和基质上重复该过程。进行共聚焦成像以检查蛋白质的定位。发现僵硬取决于年龄和肥胖。与8周小鼠相比,15周小鼠上皮的杨氏模量更大。在15周时,对照组的上皮明显大于肥胖小鼠的上皮。Crb3和PKCζ在顶端上皮的定位存在差异,肥胖小鼠缺乏片状延伸。在2型前糖尿病肥胖小鼠中,硬度斜率存在差异,损伤后纤连蛋白的定位可以忽略不计。这些表明,饮食引起的年龄和环境变化会随着年龄的增长而改变组织的完整性,使其更僵硬。来自2型前糖尿病肥胖小鼠的角膜明显较软,这可能是由于顶端表面蛋白质的变化表明缺乏完整性和纤连蛋白减少。

2. 材料和方法

2.3. 纳米压痕

角膜上皮和基质硬度用Piumanano压痕系统(Optics11,阿姆斯特丹,荷兰)测量。为了进行测量,头部被固定。将眼睛浸入磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,并将探针降低到角膜的中心。探头的半径为26μm,刚度为4.4 N / m。通过10μm压痕进行上皮测量。

为了检查基底膜和基质,对上皮进行了磨损。使用各种压痕深度进行测量,范围从1μm到17μm。使用基于赫兹接触力学模型的内置PIUMA软件计算样品的杨氏模量,假设角膜组织不可压缩,泊松比为0.5。加载曲线通过软件拟合到以下方程中:其中F表示施加的力,表示有效杨氏模量,表示球尖半径,并表示压痕深度。我们用于分析的体积杨氏模量是使用以下公式生成的:其中表示被测材料的泊松比。

3. 结果

3.1. 僵硬取决于年龄和肥胖

在接下来的实验中,我们将8周和15周的小鼠与天然发生的小鼠肥胖模型(2型糖尿病小鼠前)进行了比较,以检查上皮和基质硬度的变化。使用来自5只8周对照小鼠,5只15周对照小鼠和2只DiO 15周龄小鼠的双眼。之前,我们证明了肥胖小鼠角膜的角膜上皮伤口修复受损[。这些结果刺激我们检查角膜的变化,这可能是细胞迁移和伤口修复变化的根本原因。在中,我们检查了完整眼睛中上皮,基底膜和基质的硬度。计算Young氏模量,15周C57Bl6小鼠的完整角膜上皮显着大于8周小鼠的完整角膜上皮(Wilcoxon秩和检验,*** p < 0.01)。在同等年龄时,上皮显著大于年龄匹配的DiO小鼠角膜(Wilcoxon秩和检验,*** p < 0. 01)。在这里,小鼠的背景相似,DiO小鼠被喂食高脂肪饮食15周。




图1.8周对照的角膜上皮硬度(平均值±标准差),假设角膜组织不可压缩,泊松比为0.5。

4.4. 讨论

角膜是的,因为它作为眼睛的折射表面发挥着基本功能,同时也在眼睛和外部环境之间保持了不透水的屏障。我们已经表明,僵硬的变化随着年龄的增长以及肥胖小鼠(DiO)而发生,这是II型糖尿病前期的模型。之前,我们证明了DiO小鼠的角膜愈合速度明显慢于对照C57BL6小鼠的角膜[]。我们在本手稿中的数据支持一份报告,即与对照组相比,糖尿病前期患者的角膜表面疾病发病率增加(分别为20.67%和3.33%;p < 0.05) []。

我们证明,年龄匹配的动物的上皮硬度与年龄和饮食有关。由于DiO动物的上皮不那么坚硬,我们反映了上皮完整性的变化,并对顶端上皮中常见的极性蛋白进行了染色。我们检查了未受伤和受伤的角膜,因为平面极性可以通过几种不同的线索引发,包括生长因子和/或细胞外基质的变化]。这些线索被认为被转化为定向迁移,这需要通过信号通路重组细胞成分。这些蛋白质通常局限于迁移细胞的前部,导致细胞骨架变化,前缘膜突起和定向运动[这些变化在对照中观察到,并在DiO角膜中被修改。先前,在其他组织中发现Crb3在分化的分泌细胞和分化的纤毛细胞中定位于顶端表面]。

在基底膜和基质中也检测到刚度的差异,通过基质的刚度变化百分比发生变化。所有测量均在中央角膜中进行。刚度变化的原因尚不清楚[]。表明随着年龄的增长,结缔组织的特征是晚期糖基化终产物(AGEs)的积累,并且糖尿病患者受其积累的影响更大。这很重要,因为它可以改变基质中丰富的蛋白质(如胶原蛋白)的糖基化。他们对体外肌腱的研究表明,AGEs会降低组织的粘弹性。关于AGEs随时间积累及其对胶原纤维和蛋白聚糖间距的影响的数据尚不清楚。

在最近的一篇综述中,McKay等人指出,胶原蛋白交联提供了维持角膜完整性的强度,衰老和糖尿病与胶原交联的增加有关[]。然而,该评价随后指出,虽然糖尿病人群的角膜滞后和角膜阻力因子升高,但存在不一致之处,他们提出这是由于人类患者群体的异质性。糖尿病人群中的一致性极难控制,原因包括疾病的严重程度和持续时间。出于这个原因,随着时间的推移,对几种不同的小鼠糖尿病模型的研究将很有趣,以解决这个问题。McKay确实报告了基质厚度增加,根据研究的不同,刚度没有或中度增加。在我们的研究中,我们发现DiO角膜Kneer等人(2018)的基质厚度增加。

其他研究者假设这种增加与糖尿病有关,并发现在其队列中,LOX与糖尿病或肥胖无关[]。虽然我们测量了僵硬,但我们没有测量LOX,需要在饮食的不同时间在DiO小鼠中检查其表达。事实上,他们的体外研究表明,升高的LOX与缺氧的关联更大。此外,Mankus等人(2012)在P2X7敲除小鼠中证明,LOX与III型胶原蛋白一样升高,并不表示交联增加[]。然而,在DiO小鼠和糖尿病人角膜中,P2X7 mRNA显著升高7-10倍[。这种升高表达的功能含义尚不清楚。在我们目前的研究中,没有进行胶原纤维测量,未来的研究将进一步检查基质的细胞外基质。蛋白聚糖的硫酸化可能会发生变化,因为这也可能影响刚度。

我们的研究表明,DiO角膜伤口愈合受损可能反映了硬度的差异或基质分子(如纤连蛋白)的变化。在对照中,与DiO角膜相比,沿着基质神经和对照前缘检测到纤连蛋白。缺氧角膜中检测到纤连蛋白减少,与对照组相比,角膜愈合延迟[]。甚至有可能缺乏顺应性反映了纤连蛋白的减少,因为体外研究表明,纤连蛋白的拉伸会导致其展开,导致隐秘结合位点暴露[。纳米压痕仪在不同年龄和环境压力下对相同背景的小鼠的使用为具有许多相互矛盾数据的领域提供了对照研究,因为人类模型非常复杂。随着时间的推移,将对肥胖和非肥胖小鼠的2型糖尿病模型进行其他研究,以进一步测试我们的结果。识别改变角膜完整性的特定因素将用于治疗和预防变化。总之,研究角膜的物理特征,如原位僵硬,可以深入了解控制和患病条件下伤口修复的机制。

如果您感兴趣的话,我们可以为您提供试样服务。

生物组织纳米压痕仪介绍
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The Piuma 纳米压痕仪专为迎合生物材料以及组织研究人员和工程师的需求,提供易用性和便携性,同时提供高精度、高通量和多样化的数据。Optics11小型化的玻璃探针式压头,特别适合在液体中测量水合样品。组织工程和再生医学的研究者,Piuma纳米压痕仪是衡量他们感兴趣材料刚度的一个解决方案。 

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软物质材料表征

在生物材料、组织工程、再生医学和医学研究领域,Piuma可以在溶液里进行非破坏性测量测量某点或者某个区域的杨氏模量、蠕变和松弛实验,点阵测量粘附力,描述应变硬化行为,样品的粘度等。测试生物材料和组织样本的软硬度可以很容易地在Piuma纳米压痕仪上用其optics11 PIUMA探头和专用的Piuma软件来实现。 

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