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微尺度机械测试仪MicroSquisher凝胶支架比干细胞递送的构建

 发布时间:2022-10-13 点击量:320

抽象

致密胶原 (DC) 凝胶促进接种牙髓干细胞 (DPSC) 的成骨细胞分化,并在体外和皮下与生物活性玻璃颗粒结合时经历快速无细胞矿化然而,DC生物活性玻璃混合凝胶在将DPSC输送用于骨质部位骨再生的潜力尚未得到研究。在这项研究中,无细胞和DPSC种子DC-S53P4生物活性玻璃的功效[(53)SiO2-(23)钠2氧-(20)曹(4)P2O5,wt%]杂交凝胶在临界大小的小鼠颅骨缺损中进行了研究。将骨刺激性生物活性玻璃S53P4掺入DC凝胶中,导致其在体外模拟体液(SBF)中加速无细胞矿化,其中在1天内检测到羟基碳化磷灰石。到SBF的第7天,微机械分析显示矿化凝胶的压缩模量增加了8倍。 生物活性玻璃对DC-S53P4中的人- DPSC的原位效应是显而易见的,因为它们在没有成骨补充剂的情况下成骨分化。在成骨培养基中培养时,碱性磷酸酶和I型胶原蛋白的产生进一步增加。DC-S53P4构建体的这种骨刺激作用在体内得到证实,植入8周后,无细胞支架和DPSC接种的DC-S53P4构建体均形成矿化和血管化的骨基质,具有成骨细胞和破骨细胞活性。然而,令人惊讶的是,体内显微CT分析证实,无细胞支架产生了更大体积的骨骼,在第3周已经可见,并且表现出优越的小梁结构。这项研究的结果表明,DC-S53P4支架否定了干细胞递送有效骨组织再生的需要,并可能加速其临床应用。

2. 实验方法

DC-S53P4支架的生物活性和机械性能

如前所述,使用大久保的SBF研究了生物活性[31]。将DC和DC-S53P4支架以1:15 (mg/mL)DC/SBF比(25 mL SBF)置于SBF中,并在6 h、第1、3和7天评估矿化程度,每3天更换一次溶液[1011]。如上所述,进行了扫描电镜、透射电镜和XRD分析。在每个时间点使用微尺度机械测试仪(加拿大,cellscale,MicroSquisher)以100μm / s的压缩速度对湿水凝胶支架进行压缩机械测试(n = 5)。

MicroSquisher是一个微型机械测试系统,MicroTester细胞微压缩可以做别人所不能做之事。更小的标本,更好的解像力,更容易的测试设置和更好的视觉效果。应用包括小组织样品,水凝胶微球,细胞球体和工程化组织生长基质。为了适应所有用户的广泛应用,CellScale推出了两款MicroTester!

3. 结果

DC-S53P4脚手架的制造和表征

无细胞和细胞接种DC-S53P4凝胶支架表面形态的SEM显微照片证实了在纤维胶原基质结构中掺入生物活性玻璃颗粒(图1B)。将S53P4添加到DC表明胶原纤维与生物活性玻璃表面(图1B,I)和交织的细胞S53P4和胶原纤维结构(图1B,II)的结合。制造的无细胞直流支架的ATR-FTIR光谱(图1C)显示了在1643,1550和1243 cm处通过酰胺I,II和III带进行的特征性胶原蛋白键合−1分别为[11,12]。S53P4的光谱显示硅酸盐振动的存在,Si-O-Si在1000和1100厘米之间−1;与SiO的非桥接氧键−1在 900 厘米−1 [36];和生物活性玻璃内的大气碳酸盐,位于897和1400厘米处−1 [DC-S53P4支架的光谱显示了特征性的胶原酰胺I,II和III键,而生物活性玻璃的掺入掩盖了胶原侧链在1100-800 cm中的振动−1区域,而不是显示 Si-O-Si 和非桥接氧键与 SiO−1 [同样,S53P4光谱中存在的碳酸盐峰在杂交后再也无法观察到[11,37]。

3.2. 无细胞DC-S53P4支架在SBF中的矿化作用

在SBF中检查DC-S53P4杂交凝胶支架的无细胞生物活性长达7天。对DC-S53P4的SEM显微照片的定性研究表明,SBF中矿物的形成水平随时间的变化而增加(图2A)。相比之下,仅DC在SBF的7天内显示出矿物形成的证据很少(图。S1)。DC-S53P4 的 ATR-FTIR 光谱(图 2B)表明 v3 PO 的吸收带随时间变化增加43−在 1022 厘米−1, v4 采购订单43−在 560 和 600 厘米−1, v2 一氧化碳32−在 873 厘米−1和 v3 一氧化碳32−在 1460 厘米−1以及 v1 PO 的强化43−在 960 厘米−1,均提示HCA在胶原基质内的形成和生长[38]。此外,S53P4的XRD衍射图(图2C)显示出无定形玻璃的特征图案,而制造的DC-S53P4在约20°2 θ处表现出宽衍射图案,这归因于胶原纤维的随机取向[10]。在SBF中6小时后,这种无定形的宽衍射驼峰变得更小,不那么突出。随着浸泡时间的进一步延长,从第1天开始观察到与特征羟基磷灰石有关的峰(ICDD参考号009-432,图2D),这在更长的时间内变得更加明显。峰的增加和变窄不仅表明DC-S53P4支架内羟基磷灰石的增加,而且表明支架通过暴露于SBF从无定形结构到晶体结构的转变。相比之下,SBF中的直流脚手架(图1000)。S1)在ATR-FTIR光谱中未显示表明磷酸盐含量增加的峰,并且XRD模式仅显示第7天宽峰色散的轻微指示,类似于在SBF中6 h后DC-S53P4的模式。微机械压缩测试表明,在SBF的7天内,DC-S53P4的刚度增加了8倍(图3)。直流与S53P4杂交和SBF时间(p<0.0001和p<0.01)的压缩模量均有统计学意义增加,而仅直流支架的压缩模量随SBF浸泡时间的增加没有显著增加(p>0.05)。

图 2

图 2.无细胞DC-S53P4支架在SBF中的矿化进展.(A) 在 SBF 中第 (I) 天、第 1 天 (II) 第 3 天和第 (III) 7 天时 DC-S53P4 的扫描电镜图像,(IV) 在第 7 天显示 DC-S53P4 的放大倍率较高。所有比例尺 = 5 μm。(B) 指纹区域的 ATR-FTIR 光谱,描绘了 DC-S53P4 在 SBF 中 7 天内的矿化情况。(C) SBF 中 DC-S53P4 的 XRD 图谱和 (D) 羟基磷灰石的参考 XRD 图谱 (ICDD 9–432)。无花果。S1 显示了超低频中直流的扫描电镜、反光栅光谱和 XRD。

图 3

图 3.通过矿化改变脚手架机械性能。在 SBF 中 7 天内 (A) 直流和 (B) DC-S53P4 的代表性压应力-应变曲线。(C)直流和DC-S53P4中平均压缩模量随时间的变化在SBF中。根据学生 t 检验,误差线± SD 和 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

3.3. HDPSCS在DC-S53P4中的代谢活性和活力,体外

为了验证DC-S53P4支架的细胞反应和成骨潜力,在对照和成骨培养基(分别为CM和OGM)中在支架中培养接种的hDPSC长达28天。在DC-S53P4中接种的hDPSC的代谢活性最初增加后,作为培养时间的函数略有减少(图4A)。在DC中接种并在CM中培养的hDPSC的代谢活性似乎在第7天达到峰值,随后随着培养时间的增加而降低。从第14天开始,观察到在所有条件下培养的细胞的代谢活性是稳定的。第7天的活/死分析证实CM和OGM中死细胞的存在最小(图4B)。第28天,通过使用Hoechst测定法(图4C)测量DNA来量化支架内的细胞数量,每个支架的细胞数量都在150,000至170,000个细胞之间,并且在CM和OGM中DC和DC-S53P4之间没有显着差异,表明所有支架中的平衡细胞数量。

图 4

图 4.接种的hDPSC在DC和DC-S53P4支架中的代谢活性和活力。(A)接种在(I)DC和(II)DC-S53P4中的hDPSCs的代谢活性,如阿拉玛蓝®还原测定在对照(CM)和成骨培养基(OGM)中长达28天所示。(B)在第7天接种在DC-S53P4中的hDPSCs的活/死图像,分别在(I)CM和(II)OGM中用绿色和红色荧光指示活细胞和死细胞。比例尺 = 200 μm。(D)第28天存在的细胞数量,通过CM和OGM的赫希斯特33258 DNA测定进行定量。根据学生 t 检验,± SD 和 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 和无显著性 (ns) > p 为 0.05。(为了解释此图例中对颜色的引用,读者请参阅本文的网络版本。

hDPSC种子DC-S53P4杂交支架的体矿化和成骨分化

进行组织学分析以评估DC和DC-S53P4支架的细胞分散和矿化潜力。Masson的三色在所有条件下都显示出均匀的细胞在两个基质上的分散,而茜素红和Von Kossa染色表明,无论添加生物活性玻璃,当应用OGM时,钙和磷酸盐的沉积分别增加(图5A)。组织学分析证实了生物活性玻璃对矿化的影响,其中在无细胞DC-S53P4支架内观察到轻微的矿化迹象(图.S3)。

图 5

图 5.hDPSC种子直流和DC-S53P4支架的矿化和成骨分化。将支架在对照组(CM)和成骨培养基(OGM)中培养,并在第28天使用组织学分析和蛋白质印迹进行评估。(A)马森三色,茜素红和冯·科萨的组织学染色。所有比例尺均为 100 μm。(B)ALP,I型胶原蛋白和β肌动蛋白的蛋白质印迹(3个独立实验)。(C)ALP和I型胶原蛋白的定量。数据以归一化为β肌动蛋白。根据学生 t 检验,SD 和 *p ±误差线< 0.05、**p < 0.01。(为了解释此图例中对颜色的引用,读者请参阅本文的网络版本。

蛋白质分析表明,当接种在DC-S53P4中并在OGM中培养时,细胞的ALP产量显着增加(p <0.001)(p <0.001)(图5B和C)。与所有其他条件相比,杂交DC-S53P4和OGM中hDPSC的培养也导致I型胶原蛋白产量显着增加(p <0.05)(图5B和C)。微机械压缩试验表明,在OGM培养时,支架压缩模量显著增加(p <0.001),但S53P4的存在没有显著影响(p = 0.37)(图中。S2)。


4. 结论

该研究提出了一种DC-S53P4生物活性玻璃混合水凝胶作为治疗临界大小骨缺损的合适支架。体外调查证实了这些DC-S53P4支架的快速矿化和骨刺激性质。此外,在植入无细胞支架和mDPSCs种子构建体的临界尺寸颅面缺陷中,在体内观察到具有组织胶原原纤维和血管网络的矿化骨基质。然而,新形成的骨的数量和质量在无细胞DC-S53P4支架中出现较大。虽然骨愈合的机制尚未确定,但DC-S53P4支架为骨组织工程提供了一种有希望的无细胞策略。

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MicroSquisher 图像



试样和安装

平行板压缩
样品:300μm水凝胶微球(30KPa)
峰力:20mN
悬臂弯
试样:20μm厚、4mm宽箔带(70MPa)
峰力:3mN
平行板压缩
标本:直径2毫米的水凝胶圆柱体(12KPa)
峰力:20mN
球形压痕
样品:1.5mm直径压头压入水凝胶(2KPa)
峰力: 12mN
弯曲引起的拉伸
标本:蜘蛛丝
峰力:2mN
穿刺附着拉伸
样品:3.5mm宽,1.5mm厚的水凝胶(0.5KPa)
峰力:1.4mN

技术信息


MTG2MTLT
外形尺寸56 X 14 X 24cm52 X 17 X 21cm
重量9kg6.5kg
力度大小500mN500mN
可用的力传感器0.005, 0.02, 0.08, 0.2, 1, 5, 25, 100, 500mN0.005, 0.02, 0.08, 0.2, 1, 5, 25, 100, 500mN
力的准确性约换能器容量的0.2%约换能器容量的0.2%
最大夹点分离约10mm约10mm
最大速度5mm/s5mm/s
最大循环频率0.1Hz0.1Hz
最大数据频率5Hz5Hz
Actuator TechnologyPiezo-electric MotorStepper Motor
Actuator Resolution0.1um1um
Range of Field of View0.4-11.0mm0.8-5.5mm
Vertical Image Resolution2048px1536px
Secondary Camera OptionYesNo
Secondary Test Axis Option (Shear)YesNo